荧光分光光度计的原理

2.1 基本原理

以下流程图表示一般的荧光分光光度计。
激发光源是一个为样品提供照射光的光源，一般使用氙灯。

由激发光源发出的白光进入激发侧单色器，测定激发光谱(吸收光谱)时，改变激发光的波长，测定荧光强度对应的变化，测定荧光光谱时，激发波长固定，测量荧光强度随发射波长的变化。
来自激发侧单色器的光照向样品，沿着这个路径，半透半反镜会将光束分离，一部分光到达监控检测器，监控检测器用来监控激发光到达样品的强度，检测器通常使用光电管、光电二级管、光电倍增管等。当激发光到达样品时，样品被激发以发出荧光，发出的荧光进入荧光侧单色器。
在测量激发光谱时，荧光侧单色器选择特定的波长固定。当测量荧光光谱时，荧光侧单色器通过移动以测量发射波长。
离开荧光侧单色器的荧光会进入荧光检测器(5)，通常是光电倍增管，荧光检测器会将荧光转换为模拟电信号，再经过A/D转换电路（6）转换为数字信号，通过计算机（7）控制波长扫描和信号处理。

2.2 使用的组件

以下是荧光光度计的光路系统图。

2.3 性能比较时的注意事项

仪器系统的性能指标在其目录最后一页有描述，在这里介绍术语的含义和如何读取这些数字。

灵敏度：使用者最在乎的一个指标。这是来表明如何获得噪声小且数据平滑的指标，该指标越大，系统越好。它也被称为信噪比。但是，灵敏度的测量条件不同，这个指标的数字也不同。若测量条件不一致，如狭缝、响应（时间常量）等，则无法进行不同系统的比较。一些制造商在有利条件下测试灵敏度，将其展示在仪器手册中。
光源：除个别案例外，仪器制造商一般使用150W氙灯作为光源。无臭氧灯在波长小于220 nm处提供很弱的光，若使用小于220 nm的波长作为激发光则是不可能的。
波长范围：测量波长越宽，应用越广。
狭缝：也称为带宽，它代表在光度计入口和出口处狭缝的宽度。如果狭缝宽度大，则由于光量增加而可以获得具有相对较低噪声（灵敏度高）的数据，但是，无法确定光谱的细微峰值。如果狭缝很窄，则可以确定光谱的细微峰值，但是光量会减少，从而导致数据噪声增加。虽然最终结果主要取决于样品，但是考虑到荧光分光光度计对微量样品分析的灵敏度，没必要缩小狭缝宽度。
响应：如果响应较大，光谱就变得比较平滑，但是光谱形状会变钝。当测量激发、发射光谱时，应该依据扫描速度选择合适的响应。在一定扫描速度下，如果没有选择合适的响应，即使响应比较小，也有可能增加噪声，使光谱变形。
其他：如三维光谱测量，磷光测量等特殊的测量，可以通过选配软件来实现。一些仪器型号的标准配置也可执行这些测量。