肽图法在生物药品分析中的应用

生物药品是指运用重组DNA技术或细胞培养技术生产的蛋白质类药品，其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。关于其试验方法和评价方法，已经提出数种方针和准则。
此次，我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“肽图法”。肽图法是旨在进行蛋白质的特性解析、同一性或稳定性的评价、变异检测的方法。为了对多个出现肽峰的LC色谱图的洗脱模式进行比较，良好的峰保留时间和峰面积的重现性将成为非常重要的因素。在此，我们以BSA和作为生物药品代表的抗体药物（IgG）作为模型样品，使用LC测定其消化物，并对重现性进行了评价。

肽图法简介：

将蛋白质利用化学方法或酶进行消化，使用LC等仪器分离并检测生成的肽断片，通过比较其色谱模式，确认构成蛋白质的氨基酸的变化。

* 肽图法是根据三大药典（USP、EP、JP），在共同协商的基础上规定的试验方法，收录于JP（日本药典）版的参考信息中。

BSA（牛血清白蛋白）消化物的测定例

色谱条件：

色谱柱	HITACHI LaChrom C18 (5 µm) (4.6 mm I.D. x 250 mm)
流动相	A)0.1% TFA/H2O(v/v) B)0.1% TFA/CH3CN(v/v) * Gradient
流速	1.0 mL/min
柱温	40°C
检测波长	UV 215 nm
进样量	10 µL

样品配制：

* 使用动态混合器

峰保留时间及峰面积重现性（n＝6）

保留时间：

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峰 No.	1	2	3	4	5
Average	13.579	23.998	30.508	34.488	44.911
SD	0.009	0.012	0.012	0.018	0.012
%RSD	0.06	0.05	0.04	0.05	0.03

峰面积：

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峰 No.	1	2	3	4	5
Average	313951	477180	729175	922057	814068
SD	6957	11499	17599	22397	21035
%RSD	2.22	2.41	2.41	2.43	2.58

反复测定6次，峰保留时间的重现性（%RSD）在0.06%以下，峰面积重现性（%RSD）在 2.6%以下，获得了良好的重现性。据此可知，利用肽图法能够进行高可靠性的色谱模式分析。

抗体药物（IgG）的结：

生物药品中利用抗体（免疫球蛋白）的抗体药物，多为具有糖链结构的糖蛋白，因其较高的特异性和有效性而备受瞩目。虽然存在多种免疫球蛋白，但作为抗体药物而投入实际应用的主要是IgG，其特征为具有“Y”字型的四链体结构。H链、L链各2条，分别以S-S 键（二硫键）相连接，从而形成Y字型。

在此将IgG经过还原烷基化处理后利用胰蛋白酶进行消化，使用LC测定其肽断片，并对色谱模式中峰的保留时间和峰面积的重现性进行了评价。

IgG消化物的测定例

色谱条件：

色谱柱	HITACHI LaChrom C18(5 µm)(4.6 mm I.D. x 250 mm)
流动相	A)0.1%TFA /H2O(v/v) B)0.1%TFA/CH3CN(v/v) ^*Gradient
流速	1.0 mL/min
柱温	40°C
检测波长	UV 215 nm
进样量	10 µL