日本药典第16版收录药品的测定例（异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸颗粒）
在2011年4月生效的日本药典第16版中，针对异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸颗粒的鉴别试验，规定使用常规色谱柱以HPLC进行测定。
此外，关于其含量测定，规定使用茚三酮柱后衍生法进行测定。
使用 Chromaster 进行的鉴别试验
各成分的浓度：
| 成分名称 | 浓度 (mg/mL) |
|---|---|
| Val: 缬氨酸 | 1.10 |
| Ile: 异亮氨酸 | 0.92 |
| Leu: 亮氨酸 | 1.84 |
色谱条件：
| 色谱柱 | HITACHI LaChrom C18(3 µm) (4.6 mm I.D. × 150 mm) |
|---|---|
| 流动相 | (A)/乙腈= 970/30 (v/v) |
| 流速 | 0.9 mL/min |
| 柱温 | 40°C |
| 检测波长 | UV 210 nm |
| 进样量 | 20 µL |
*(A)将 31.2 g 磷酸二氢钠二水合物溶于1,000 mL的水中，加磷酸调pH值至2.8。
*调整流速，使得缬氨酸的保留时间约为 2.5分钟。
样品的配制方法：
称量相当于 92 mg L-异亮氨酸的样品，以流动相溶 解并定容至100 mL。使用 0.45 µm 滤膜过滤，作为进样样品。
鉴别试验：
鉴别试验中得到的系统适用性如下，结果满足要求值。
此外，鉴别试验的要求事项 “峰的保留时间相等”也得到了如下确认。
标准样品的系统适用性
| 项目 | 系统适用性要求值 | 测定结果 | |
|---|---|---|---|
| 系统性能 | 洗脱顺序 | Val、Ile、Leu的顺序 | OK |
| Ile-Leu 的分离度 | 1.5以上 | 2.55 | |
| 系统的重现性 | 各峰保留时间的 相对标准偏差（n=6） | 1.0%以下 | 0.05% (Va) 0.09% (Iie) 0.09% (Leu) |
鉴别试验结果
| 成分名称 | 要求事项 | 标准样品的保留时间 (min) | 样品的保留时间 (min) |
|---|---|---|---|
| Val: 缬氨酸 | 峰的保留时间相等 | 2.51 | 2.50 |
| Ile: 异亮氨酸 | 4.11 | 4.09 | |
| Leu: 亮氨酸 | 4.51 | 4.50 |
* 本分析样品由庆应义塾大学药学部 创药物理化学讲座提供。
使用 L-8900 的定量法
各成分的浓度
| 成分名称 | 进样样品中的浓度(ng/20 µL) |
|---|---|
| Gly: 甘氨酸 （内标物） | 400 |
| Val: 缬氨酸 | 960 |
| Ile: 异亮氨酸 | 800 |
| Leu: 亮氨酸 | 1,600 |
标准分析法色谱条件
| 分析柱 | #2622PH 4.6 mm I.D. × 60 mm |
|---|---|
| 脱氨柱 | #2650L 4.6 mm I.D. × 40 mm |
| 流动相 | PH Buffer Kit |
| 流速 | 0.4 mL/min |
| 柱温 | 57°C |
| 反应液 | Ninhydrin coloring solution kit for HITACHI |
| 反应液流速 | 0.35 mL/min |
| 反应温度 | 130°C |
| 检测波长 | VIS 570 nm |
| 进样量 | 20 µL |
样品的配制方法
称量相当于 0.95 g L-异亮氨酸的样品，加入 10 mL 内标溶液（甘氨酸）*，以 0.1 mol/L 的盐酸试液溶解并定容至 250 mL。
µm 滤膜过滤后，作为样品溶液。
* 内标溶液 甘氨酸的 0.1 mol/L 盐酸试液溶液（1 g/20 mL）
定量法:
含量测定中得到的系统适用性如下，结果满足要求值。
此外，将定量结果一并提供以作参考。
另外，测定条件中记载的市售试剂（流动相、反应液）与药典中规定的组成一致，因此无需配制，可直接使用。
标准样品的系统适用性
| 项目 | 系统适用性要求值 | 测定结果 | |
|---|---|---|---|
| 系统性能 | 洗脱顺序 | Val、Ile、Leu的顺序 | OK |
| Ile -Leu 的分离度 | 1.2以上 | 1.37 | |
| 系统的重现性 | 内标物（Gly）与各峰面积比的相对标准偏差（n=6） | 1.0%以下 | 0.09% (Va) 0.17% (Iie) 0.09% (Leu) |
定量结果
| 成分名 | 含有量/标示量 × 100（%） | |
|---|---|---|
| 要求值 | 测定结果 | |
| Val：缬氨酸 | 93.0 - 107.0 | 100.3 |
| Ile：异亮氨酸 | 98.4 | |
| Leu：亮氨酸 | 100.4 | |
* 本分析样品由庆应义塾大学药学部 创药物理化学讲座提供。
本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。
本仪器只是研究用仪器，而不是诊断，治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。
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