構造細胞生物学のための電子顕微鏡技術

8. 単離した分子を見る（1）

電子顕微鏡というイメージからすると分子を見ることは何でもないように思えるが、実際は難しい。確かに分解能的には十分であるが、蛋白質をはじめ生体を形成する分子は全て軽元素から構成されており、電子線を十分散乱させることができない。
電子顕微鏡のコントラストは主に電子線の散乱により形成されるので（amplitude contrast）、散乱が起こらないと像が観察されないことになる。また、蛋白質分子のように試料が小さいとピントをずらすことによる位相差像もぼけの中に埋没してしまい期待できない。合わせて、真空中で観察しなければならないことおよび電子線による照射ダメージを考えると精製蛋白質をそのままグリッドに載せ観察することは不可能に近い。したがって、簡単に見るためには染色剤で分子の周りを固めたり（ネガティブ染色）、白金蒸着したりして観察することになる（低角度回転蒸着法：low angle shadowing）。ここでは主にこれら2つの方法について紹介する。

（1）ネガティブ染色（negative staining、負染色）

精製したタンパク質あるいは複合体を高分解能で観察できる簡便な方法である。
単粒子解析などの画像処理法と組み合わせると数ナノメートルの分解能で立体像を予測できる。カーボン支持膜などを張ったグリッド（メッシュ）に試料を吸着させ、酢酸ウラン、燐タングステン酸などの染色剤をのせる。余剰の染色剤を濾紙で吸い取り、乾燥と同時に試料の周りを染色剤で固める方法である。
試料より周囲の染色剤の方が電子線を散乱するで、試料は白く浮かび上がる。すぐに観察でき分解能の高い像を得ることができるが、自然乾燥であること、染色剤の被覆の相違により像が変化することなどを考慮し、像の解釈には十分注意する必要がある。

準備するもの：

精製蛋白質などの試料
2％酢酸ウラニウム水溶液
膜張グリッド
扇型に切った濾紙
ピンセット
ピペットマン

カーボン膜張グリッドの作製：

フォルムバールの支持膜を張っただけのグリッドでもネガティブ染色に使用できるが（応用例はフォルムバール支持膜上で観察したものである）、小さい分子の高分解能ネガティブ染色には平らなカーボン支持膜を張ったグリッドが必要である。マイカを剥離し新鮮な面を露出させ、その面にカーボンを厚め（20nm）に蒸着する。水面上にカーボン膜を浮かせ、その上にグリッドを載せ切片用の支持膜と同様に紙を上から被せ回収する（図1）。一枚一枚グリッドでカーボン膜をすくって膜を張ってもいい。カーボン膜は疎水性が強いのでイオンスパッタ装置にて親水化する。

プロトコール：

染色法は変化に富んでおり、取り扱う試料により多少異なるようであるが基本的には同じと考えていい。ここでは酢酸ウランによる染色法を解説する。

試料溶液を膜張グリッド上に載せ、10分間程度静置し、試料分子を膜面に吸着させる。図2のようにグリッド上に試料滴を盛る方法とパラフィルム上に試料滴を作り、そこにグリッドを被せる方法の2通りがある。
また、最終的に試料の周囲に残留する染色剤の量を最適化するためと、キャリブレーションのために、タバコモザイクウイルスを試料に混合する人もいる。
試料溶液とほぼ同量の2％酢酸ウラニウム水溶液をたらし、試料液を洗い落とす。
パラフィルム上に2％酢酸ウラニウム水滴を2つ用意し、試料側が水滴に接するように被せる。2つの酢酸ウラニウム水滴にそれぞれ1秒位づつ接触させる。
（これは試料周囲の染色剤の純度を上げることと、コンタミを洗浄することの2つの意味がある）
濾紙で余剰の染色剤を吸収し、自然乾燥させ、電子顕微鏡で観察する（図2）。

ネガティブ染色では分子の輪郭が観察されるのであり、染色剤が中にしみ込まない限り内部は見えないはずであるが（図3）、染色剤と試料との関係は様々で、それにより見え方も多少異なる。
一般に粒子の半分より下が染色剤で覆われているほうが表面構造を鮮明に観察できる。全体に染色剤で覆われると上面と下面の構造が重なり解析が難しくなることもある（図3）。特に、両面とも規則正しい構造が含まれているとモワレにより全く関係ない模様が現れることもある。
また、試料の物性により部分的にポジティブ染色が加わることもある。分解能が高いだけ構造解析は慎重に行うべきである。図4に応用例として微小管の染色像を掲げる。